33 коллекции музея, формирование которых началось в 1940 году на базе Уральского областного музея Революции (Дом Ипатьева), насчитывают уже более 74 тысяч экспонатов и с каждым годом активно пополняются как частными коллекционерами и дарителями, так и государственными и общественными организациями.

Начало коллекции Музея истории Екатеринбурга было положено в марте 1939 года, когда в Доме Ипатьева была создана временная выставка, приуроченная к 20-й годовщине смерти революционера Якова Свердлова.

В годы Великой Отечественной войны 1941-1945-х годов музей стал «шефом» Государственного Эрмитажа, помогая коллегам эвакуированного главного музея страны выставочным оборудованием и монтажом выставок.

В 1946 году при ликвидации Уральского музея Революции Фонды перевезли в Государственный мемориальный музей Свердлова на улице Карла Либкнехта, 26. Так было образована единая «революционная коллекция», включившая в себя документы и фотографии, редкие книги и артефакты по политической истории Урала начала ХХ века. Благодаря советским художникам и ветеранам революции активно формировалась художественная коллекция и предметы быта. В советские годы была сформирована основная часть нумизматического и оружейного фондов, а также коллекция драгоценных металлов.

В период преобразований в стране 1991-1995-х годов, музей получил статус Музея политической истории Урала (общественно-политического движения), что позволило сформировать одну из самых больших российских коллекций по истории современной политики. Наряду с этим началось формирование собраний, которые отражали все стороны жизни Екатеринбурга, что привело в 1995 году к решению о переименовании в Музей истории Екатеринбурга. Музей стал центром комплектования семейных архивов города и местом спасения закрывавшихся в 90-е годы общественных и ведомственных музеев, архивов и библиотек. Благодаря этой работе была воссоздана историческая «Библиотека Софьи Адольфовны Тихоцкой» (открытое хранение коллекции редкой книги) и «Метальная лавка» (открытое хранение коллекции металла).

С середины 1990-х годов Музей истории Екатеринбурга начал создавать Музей уральской фотографии «Дом Метенкова». Открытие музея-филиала состоялось в дни празднования 275-летия Екатеринбурга в 1998 году. А коллекция музея с того времени превратилось в одну из самых значимых российских музейных фотоколлекций, включающих практически все направления памятников мировой и отечественной светописи 1860-2010-х годов.

В начале 2000-х годов было принято решение о закрытии Уральского музея молодежи, изначально создававшегося с 1980-х годов как филиал Дома-музея Я.М. Свердлова. Таким образом, к 2006 году в фонды Музея истории Екатеринбурга влились обширные коллекции — по истории молодежного движения и документы по репрессиям 1930-1950-х годов, уникальная по своей полноте и составу коллекция современного искусства ХХ века, а также фонды уральцев, принимавших участие в локальных войнах и конфликтах с участием Вооруженных Сил СССР.

Ныне экспонаты музея и помещения хранилищ (до появления нового открытого фондохранилища) располагаются в бывших комнатах гостиницы екатеринбургского почтмейстера Гаврилы Лайшевского 1820 года и в помещениях первого уральского кино-магазина Вениамина Метенкова 1910-х годов. В старину в этих интерьерах были: литейная мастерская и комфортабельные номера для приезжих, квартира семьи горного инженера Качки и кабинет для чтения Тихоцкой, иконостасная мастерская Кожевникова и массажный кабинет Бок, квартира основателя уральских конкурсов красоты и циркового деятеля Москвича, подпольные народнические кружки 1870-х годов и школа агитаторов-пропагандистов 1905 года, коммунальные квартиры и литография Бодэ, институт туберкулеза и первая уральская киностудия, часовая мастерская Тихоцкого и колбасная мастерская, трактир Поклевских-Козелл и апартаменты члена Государственного Совета Российской Империи Филиппа Иванова.

День своего основания музей празднует 4 июня — дату официального открытия первой экспозиции музея в 1940 году.